近年来，液体活检因其侵入性小以及能够实现频繁或连续的样本采集，吸引了越来越多的研究关注。这种技术能够持续跟踪肿瘤进展和治疗反应，其中细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）作为一种由细胞释放的膜结构，正逐渐成为重要的生物标志物。EV含有多种分子成分，包括脂质、蛋白质和RNA，因其能真实反映活体细胞的状况，近年来在生物医学领域的应用日益增加。

研究表明，EV中的miRNA生物标志物面板在诊断性能上普遍优于单一生物标志物，并且EV中的miRNA在血浆中的诊断价值略高于血清。一项针对前列腺癌患者尿液中miRNA表达差异的研究显示，10种尿液miRNA可以作为早期检测前列腺癌的工具。此外，针对EV长链RNA的研究表明，血液来源的EV中的长链RNA表达谱在胰腺导管腺癌的诊断中也表现出良好的生物标志物特性，有效区分健康个体与恶性肿瘤患者。

在传统的研究方法中，血液中的cfRNA研究主要采用短读长测序，然而这种方法在解析全长转录本异构体和复杂RNA加工事件方面存在很大限制。相较之下，cfRNA中来源于细胞外囊泡的RNA，因其更好的完整性和较长的长度，采用长读长RNA测序技术可以直接对EVRNA全长转录本进行测序，从而发现更多新型的RNA异构体，为临床应用提供更高效、准确的价值。

美国加州大学圣克鲁兹分校的Daniel Kim研究小组同样意识到长读长测序的优势，专注于利用这项技术进行血液EVRNA的检测，验证EVRNA在疾病诊断中的潜力。研究发现，现有的基于DNA的液体活检方法可能错过癌症早期阶段，而早期诊断能够更早干预治疗，从而降低死亡率。

在这一背景下，研究小组运用了COMPLETE-seqRNA流程，通过高特异性的膜亲和技术及硅胶膜柱法提取血浆EVRNA，并结合纳米孔长读长技术和短读长技术进行测序，全面获取EVRNA转录组信息。研究结果表明，血液中的重复RNA序列含量丰富，并可作为特定疾病的诊断生物标志物。相关研究成果已发表在Nature Biomedical Engineering期刊上。

COMPLETE-seqRNA流程首先从血浆中提取EVRNA，并将其反转录为cDNA后进行文库制备，接着进行短读长测序和基于纳米孔技术的长读长测序，随后开展基因差异表达分析及cfRNA长度分析。研究显示，几乎所有胰腺癌患者的血液中均发现有大量来自重复序列的游离RNA，其中大部分来源于SINE元件。

研究小组利用癌症基因组图谱计划（TCGA）中的食道癌测序数据以及GTEX联盟的大型健康样本队列，探测癌症特异性的食道RNA特征，结果发现“数百个重复衍生的转录本在食道癌中大量且特异性富集”，由此表明重复RNA序列可以作为疾病特异性的诊断生物标志物。

以往研究认为血浆中的cfRNA往往短小且出现降解，但本研究通过全长cDNA的纳米孔测序，对胰腺癌患者与对照组血浆样本中的cfRNA进行了表征，结果明显偏离之前的观点。长读长测序数据显示，mRNA长度可达1,337nt（中位数456nt），lncRNA为970nt（中位数303nt），这表明纳米孔测序成功揭示了全长、多腺苷酸化、带帽子的RNA分子的存在，其中包括lncRNA。

研究中，首先将健康对照及胰腺癌患者的血液样本分离为血浆，接着使用exoRNeasy（QIAGEN）试剂盒处理后分离EVRNA，最终进行cfRNA的长读长及短读长测序。长读长测序数据表明，各种RNA的完整性良好，未发生降解。为了实现快速、高效的EVRNA分离，该流程支持多样本的提取后，可直接在柱上完成裂解，结合QIAGEN经典的硅胶膜技术，实现高纯度总RNA的提取，适用于各种小RNA的检测与分析。

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